style="width:4.39998in;height:3.6399in" /> 本文是学习GB-T 34720-2017 山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了山羊接触传染性胸膜肺炎临床症状、病理变化、流行病学临床诊断及病原分离鉴定、
PCR、 间接血凝试验等实验室诊断的技术要求。
本标准适用于山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断。
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(Base Pair)
CCPP: 山羊接触传染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia)
CCU: 颜色变化单位(Color Change Unit)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTPs: 脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphates)
IHA: 间接血凝试验(Indirect Heamagglution Assay)
Mccp: 山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.
capripneumoniae)
MTA: 改良 Thiaucourt 氏琼脂培养基(Modified Thiaucourt's Agar)
MTB: 改良 Thiaucourt 氏肉汤培养基(Modified Thiaucourt's Broth)
PBS: 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution)
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
PPLO: 类胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonia-like Organism)
TAE: 核酸电泳缓冲液(Tris-Acetic acid-EDTA)
Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)
3.1.1 急性病例：潜伏期2 d～28d 。
初期病羊咳嗽、不愿走动并出现发热(达41℃或以上),逐渐出现
呼吸急促(有时会发出呼噜声)和剧烈咳嗽等症状，发病后期，病羊四肢外展站立且脖颈伸直，口鼻持续
流涎，鼻孔逐渐被脓性分泌物堵住，舌头伸出，死亡。
3.1.2 慢性病例：病程持续时间长，可达数月，
一般仅表现消瘦、厌食、间歇性咳嗽、流涕和发热(持续
3.2.2
急性病例：肺组织肝变(多数为单侧非对称性肝变，呈葡萄酒颜色)、肺和胸膜粘连、胸腔积有纤
维性渗出液等，严重时胸腔渗出物暴露于空气中在肺表面形成一层胶状包膜。
3.2.3 慢性病例：肺组织局部出现小面积肝变或坏死灶。
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3.3.1 本病主要依靠飞沫和接触传播， 一年四季均有流行，冬春季节多发。
3.3.2
所有年龄、性别的山羊对本病均易感。耐过病羊在相当长时间内可通过呼吸道向外界排毒，成
为传染源。
3.3.3
环境和应激因素如营养缺乏、气候骤变、羊群密集、长途调运、寒冷潮湿等情况下易诱发本病。
3.3.4
非疫区首次发病羊多呈急性经过，死亡率高；疫区羊发病多呈慢性经过，死亡率低。
符合3.1、3.2、3.3的临床症状、病理变化及流行病学特征的发病羊，可判定为疑似山羊接触传染性
胸膜肺炎。
4.1.1.1
将棉拭子伸入待检山羊鼻腔内采集分泌物；无菌采集肺脏病变部位、特别是病变部位和非病变
部位交界处的肺组织和纵隔淋巴结；若有胸水则无菌采集后，分别放入灭菌容器保存。
4.1.1.2 无菌采集羊颈静脉血，常规方法分离血清。
4.1.2.1 样品采集后，置冰上冷藏送至实验室检测。
4.1.2.2
血清储存应置于-20℃冰箱，检测前应在56℃水浴灭活30 min。
4.1.2.3 棉拭子、组织样品和胸水储存应置于一70℃冰箱。
4.2.10 微型震荡器。
4.2.11 水浴箱。
4.2.12 96孔 V 型(110°)聚苯乙烯血凝反应板。
4.2.13 移液器。
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除另有规定外，生物试剂为生化试剂级、化学试剂为分析纯。 MTB 培养基(见
A.1)、MTA 培养基
(见 A.2)。
4.3.2.1 鼻拭子置于1 mLMTB
培养基中，充分捻动，挤干后弃去拭子，3000 r/min 离心10 min, 取上 清0.5
mL, 作为接种材料。
4.3.2.2 组织样品用剪刀剪碎，每0.1 g 加 MTB
培养基0.9 mL, 研磨匀浆，3000 r/min 离心10 min, 取 上清0.5 mL,
作为接种材料。
4.3.2.3 胸水用MTB 培养基1:1稀释后，3000 r/min
离心10 min, 取上清0.5 mL, 作为接种材料。
取样品上清液接种4.5 mLMTB 培养基，标记为10⁻
¹管，并作10倍系列稀释至10-3管。同时，从
各个稀释度(10-¹~10-3)试管中取0.2 mL 接种 MTA
培养基(培养皿),用封口膜封口。将3个稀释度
的 MTB 试管和 MTA 平皿置37℃培养。
4.3.4.1 MTB 培养物
4.3.4.1.1 连续观察7 d
。若培养基颜色变黄、不浑浊或轻微浑浊，则判为样品分离疑似阳性，取样按
4.3.5方法进行鉴定；同时取样接种到 MTA
培养基上，按4.3.4.2方法进行克隆纯化。
4.3.4.1.2 若培养基变黄但明显浑浊，应将3管培养物用孔径0.45 μm
微孔滤膜过滤后，再接种到 MTB
培养基中，按4.3.4.1.1方法进行观察和克隆纯化。
4.3.4.1.3
若培养基不变黄且不浑浊，则3管均盲传1代，按4.3.4.1.1方法进行观察和克隆纯化；盲传
后仍未变黄则弃之。
4.3.4.2 MTA 培养物
4.3.4.2.1 接 种 3 d
后每天用低倍显微镜(4倍～10倍物镜)观察培养皿，连续观察至第15天。若有支
原体生长，应为典型的有“中心脐”菌落：肉眼不易看见的极小的水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央
有乳头状突起，直径约0.2 mm～0.5 mm
;则判为样品分离疑似阳性。切取菌落(含琼脂块),倒置在一 个新的MTA
培养基的琼脂表面，轻轻动琼脂块进行克隆纯化，切取克隆纯化的单个菌落(含琼脂块)进
行鉴定。
4.3.4.2.2 若15 d 后仍未见支原体菌落生长，则弃之。
将4.3.4.1和4.3.4.2中样品分离疑似阳性的培养物和克隆纯化的单个菌落，按照4.4做进一步
鉴定。
样品分离疑似阳性，且 PCR
方法鉴定结果阳性，则判为山羊接触传染性胸膜肺炎病原分离阳性，表
述为检出山羊支原体山羊肺炎亚种。否则，表述为未检出山羊支原体山羊肺炎亚种。
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灭菌生理盐水(0.85%氯化钠溶液),市售基因组DNA 提取试剂盒，2×PCR
反应预混合液(含 Taq 酶),6×PCR 上样缓冲液，DNA
分子质量标准，适宜的核酸染料，TAE 电泳缓冲液(见 B.1),1% 的琼脂
糖电泳凝胶板(见 B.2)。
采用引物 Mccp-spe-F/Mccp-spe-R
用于山羊支原体山羊肺炎亚种核酸的检测，靶基因为 arcD 基
因，产物大小为318 bp。
上游引物(Mccp-spe-F):5'-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3'。
下游引物(Mccp-spe-R):5'-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3'。
引物浓度均配成20 pmol/μL。
鼻拭子、组织和胸水等样品按4.3.2方法处理，将获得的上清液经13000 r/min
离心20 min 后，弃
上清，收集沉淀，提取 DNA。
MTB 培养物，13000 r/min 离心20 min 后，弃上清，收集沉淀，提取DNA。
MTA 单个菌落(含琼脂块),浸入1 mL 灭菌生理盐水，室温浸泡30
min,涡旋震荡，3000 r/min 离
心10 min,取上清，13000 r/min 离心20 min 后，弃上清，收集沉淀，提取 DNA。
用市售基因组 DNA 提取试剂盒，按试剂盒说明书操作，提取基因组 DNA,
立即进行 PCR 反应或
—20℃保存
4.4.4.1 反应体系
按下列方法配制50μLPCR 反应体系：
2×PCR 预混合液(含 Taq 酶)25 μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
灭菌去离子水 18μL
DNA 模板 5μL
每次反应设阴、阳性样品对照，阴性样品对照用 MTB 培养基提取的 DNA
作为模板，阳性对照用 Mecp 灭活培养物提取的DNA
作为模板；同时设阳性质粒对照(含靶基因片段序列，参见附录 C) 和空
白对照(灭菌去离子水)。
4.4.4.2 反应程序
95℃3min 进行预变性；然后进行35个循环的扩增(94℃30 s,47℃30s,72℃
30s),最后72℃
延伸5 min,4 ℃保存。
取 PCR 产物各5μL
(包括被检样品，阴性对照样品、阳性对照样品、阳性质粒对照和空白对照)分
别与1μL6×PCR 上样缓冲液混匀，连同DNA
分子质量标准，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像
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系统中观察结果。
当阳性对照(样品、质粒)有318 bp
的特异性扩增条带，阴性样品和空白对照没有相应的条带，说明
质控合格。
样品有大小为318 bp 的特异性扩增条带判为 PCR
结果阳性，表述为检出山羊支原体山羊肺炎亚
种核酸。样品无特异性的阳性扩增条带判为 PCR
结果阴性，表述为未检出山羊支原体山羊肺炎亚种
核酸。
间接血凝试验抗原，间接血凝试验阴性对照血清、阳性对照血清，间接血凝稀释液，配制方法见附
录D。
4.5.2.1 稀释被检血清和阴、阳性对照血清
在96孔聚丙乙烯反应板上进行。每份血清用1排孔，从第1孔开始，至第8孔，每孔滴加稀释液
25μL,用微量移液器吸取被检血清25 μL 加入第1孔，充分混匀后吸取25 μL
加入第2孔依次做倍比
连续稀释至第7孔(1:2、1:4、1:8 …
1:128),混匀后从第7孔弃去25μL,第8孔作为空白对照。
4.5.2.2 加间接血凝试验抗原
从第1孔开始，至第8孔，每孔滴加间接血凝试验抗原25μL。
4.5.2.3 震荡
加间接血凝试验抗原后将V 型反应板放在微型震荡器上震荡1 min,
盖上玻璃板，置37℃温箱孵
育 2 h,观察和判定凝集程度。
4.5.2.4 凝集程度的判定标准
用下列符号表示红细胞凝集程度：
—— "++++",表示100%红细胞被凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。
—— "+++",表示约75%红细胞被凝集，在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小。
——"++",表示约50%红细胞凝集，在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。
——"+",表示约25%红细胞凝集，在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。
——"士",表示25%以下红细胞凝集，沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。
——"—",表示无红细胞凝集，完全沉于孔底，呈光滑的圆点。
所设各项对照出现如下结果则试验成立，否则应重做：
——空白对照孔应全部无红细胞凝集，凝集强度为"—"。
— 阳性血清对照孔应全部凝集，凝集强度为“++++”。
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—
阴性血清对照孔仅1:2稀释度允许有不同程度凝集，其余各孔均应无凝集，凝集强度为"—
"。
4.5.2.4 中“++”或以上凝集反应的最大稀释孔判定为样品的血凝效价。当实验符合4.5.3
的条件，样品血凝效价≥1:8判为抗体阳性，表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血清学阳性。样品血凝
效价≤1:2判为抗体阴性，表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血清学阴性。当样品血凝效价介于二者之
间判为可疑，应重新检测，重新检测结果仍为可疑，则判为抗体阳性，表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血
清学阳性。
凡具有4.3.6、4.4.7、4.5.4中任何一项阳性者，均判为山羊接触传染性胸膜肺炎阳性。
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(规范性附录)
病原分离溶液的配制
A.1 MTB 培养基
A.1.1 成分
PPLO 肉汤(不含结晶紫) 21 g/L
25%鲜酵母浸液 100 mL/L
灭活马血清 200 mL/L
5%醋酸铊溶液 4 mL/L
青霉素 2 0 万 IU/L
葡萄糖 2 g/L
丙酮酸钠 2 g/L
0.4%酚红 0.18 mL
A.1.2 制备方法
将21gPPLO 肉汤溶于700mL 去离子水中，116℃高压灭菌30
min,其余成分混合溶解后用0.22 μm 滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO
肉汤中，用灭菌的1 mol/L 氢氧化钠调 pH 至7.6～7.8,分装试管或
锥形瓶等，2℃~8℃保存备用。
A.2 MTA 培养基
A.2.1 成分
PPLO 琼脂 35 g/L
灭活马血清 200 mL/L
25%酵母浸出液 100 mL/L
5%醋酸铊 4 mL/L
青霉素 2 0 万 IU/L
葡萄糖 2 g/L
丙酮酸钠 2 g/L
0.4%酚红 5 mL/L
A.2.2 制备方法
PPLO 琼脂35 g 溶于700 mL 去离子水，116℃高压灭菌30 min, 其余成分用0.22 μm
滤膜过滤； 灭菌后的 PPLO
琼脂冷却至50℃左右时加入预热到50℃左右的滤膜过滤部分，用灭菌的1 mol/L 氢
氧化钠调pH 至7.6～7.8,倾倒平皿或斜面等，2℃~8℃保存备用。
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(规范性附录)
PCR 反应溶液的配制
B.1 TAE 电泳缓冲液(pH 8.0)的配制
Tris(羟基甲基氨基甲烷)碱 242 EDTA 37.2 冰乙酸 57.1
加去离子水至1000 mL, 使用前用去离子水50倍稀释。
B.2 1% 的琼脂糖电泳凝胶板制备
g
g
mL
将琼脂糖1g 加入100 mL1×TAE
电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃左右时加入适宜的核
酸染料，均匀铺板，厚度为3 mm～5 mm。
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(资料性附录)
PCR 检测电泳例图及靶基因片段的 DNA 序列
C.1 PCR 检测电泳例图
PCR 检测电泳例图见图 C.1。
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说明：
M--DNA 分子质量标准DL2000;
图 C.1 PCR 检测电泳例图
C.2 PCR 扩增靶基因(arcD) 片段序列
大写字母为引物所在位置(Gabes 株 ，Genbank Accession No.:AY529462):
ATCATTTTTAATCCCTTCAAGtagtggaatttgcaggtgcagtatttccattattaattggtgttgttttaaaacaacaagat
gtattagcttcaggatcaattacagcattttcatttgcatcagggttagttaacttaattactccaacaagtggtgttgttatgggagttattgcaattaca
agaatcgattatggaaaatttgtaaaaggtattagtccatttgtagcagtattatcagtaagttcattaaccttattattgataggtggagcaattggtgg
aacaaTTGCATATATTATAATTACTCATAGTA(318 bp)
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(规范性附录)
间接血凝试验材料的制备和溶液的配制
D.1 间接血凝试验阳性对照血清的制备
D.1.1 Mccp 免疫用抗原的制备
D.1.1.1 灭活抗原
用 MTB 培养基培养 Mccp 模式株F38, 取对数生长期培养物2 L(≥1.0×10°CCU/mL),
向菌液中
加入40%甲醛溶液，使其终浓度为0.2%,随加随摇，使其充分混合，置37℃灭活12
h(以瓶内温度达 37℃开始计时),期间振摇3次～4次，灭活后4℃12000 r/min 离心30
min,沉淀物用0.15 mol/L
pH6.4
PBS悬浮，如上离心洗涤3次后，配成原培养液体积的1/100,测定浓度后稀释至10
mg/mL 备用。
D.1.1.2 弗氏佐剂抗原
市售弗氏不完全佐剂与 Mccp
灭活抗原等量混合、乳化，制成弗氏不完全佐剂抗原备用；市售弗氏
完全佐剂与 Mccp 灭活抗原等量混合、乳化，制成弗氏完全佐剂抗原备用。
D.1.2 免疫家兔和分离血清
选用体重2 kg
左右的健康雄性家兔。第一次免疫，用充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两
后腿足部皮下，帼淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为1.5 mL,14d
后仍以上述抗原和剂量由背部 皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11 d
后，以弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉2点，背部皮下
多点接种，接种剂量为3 mL, 为其第三次免疫；11 d
后，取制备好的不含佐剂的灭活抗原(10 mg/mL)
由每只兔耳静脉注射1.5 mL, 进行第四次高免，隔14 d
后采血，常规方法分离血清。
D.2 间接血凝试验阴性对照血清的制备
选取经血清学证实为山羊接触传染性胸膜肺炎抗体阴性的健康山羊，颈静脉采血，无菌分离血清；
或选取健康雄性家兔，心脏或颈动脉插管采血，无菌分离血清。
D.3 间接血凝试验抗原的制备
D.3.1 Mccp 纯化多糖抗原的制备
用 MTB 培养基培养Mccp 模式株F38,取对数生长期培养物2
L(≥1.0×10°CCU/mL),12000 r/min 离心30 min,取上清液，用冰醋酸调节上清液 pH
至5.0,煮沸1 h,待冷却后用普通滤纸过滤，收集滤液；
于滤液中加入无水乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，沉淀物即为多糖抗原粗制品。将
粗制多糖抗原溶解在适量灭菌水中，加入等体积配置好的60%苯酚(体积分数),混匀，68℃水浴1
h,取 出置4℃过夜后，经6000 r/min 离心30 min,取上清，并用0.1 mol/L
氯化钙溶液透析24 h;加入2倍 体积的无水乙醇，混匀，置4℃过夜后，再经7000
r/min 离心30 min,收集沉淀物用无水乙醇和丙酮分
别洗涤，然后用灭菌水溶解，过滤除菌后，即为纯化多糖抗原。将多糖抗原浓度稀释为150
μg/mL,
-20 ℃保存备用。
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D.3.2 5% 绵羊红细胞悬液的配制
颈静脉无菌采取健康成年雄性绵羊血液于灭菌的装有玻璃珠的锥形烧瓶中，均匀摇动脱去纤维蛋
白，按体积比与等量的红细胞保存液混匀，混匀后分装于灭菌瓶中(5
mL～10mL),2℃~8℃ 冰箱可
保存2个月。使用时，将红细胞移入离心管，3000 r/min 离心30
min,弃上清液，沉淀物用0.15 mol/L
pH7.2 PBS悬浮，如上洗涤4次，配成5%红细胞悬液。
D.3.3 绵羊红细胞戊二醛化和鞣酸化
取5%红细胞悬液5份与2℃~8℃保存的2.5%戊二醛1份混合，置磁力搅拌器上室温搅拌醛化
2h, 以3000 r/min 离 心 5 min, 弃上清液，沉淀用0.15 mol/L pH7.2
PBS悬浮，如上洗涤3次，配成
5%的醛化红细胞悬液，加0.01%的硫柳汞防腐，2℃~8℃冰箱保存。用抗原致敏前，将5%的醛化红
细胞悬液与等量的新配1:20000鞣酸溶液混合，置37℃水浴30 min, 以3000 r/min
离心5 min, 弃上
清液，沉淀物用0.15 mol/L pH6.4
PBS悬浮，如上洗涤3次，配成5%醛化-鞣酸化红细胞悬液。
D.3.4 抗原敏化红细胞的制备
分别取1份5%醛化-鞣酸化红细胞与1份 Mccp 纯化多糖抗原，37℃水浴作用30 min,
其间不断 搅拌，以3000 r/min 离 心 5 min
沉积红细胞，用含1%灭活健兔血清0.15 mol/L pH7.2 PBS悬浮，如
上洗涤3次，配成10%致敏红细胞悬液。使用前，用稀释液稀释成1%的使用液，即为间接血凝抗原。
D.4 间接血凝稀释液配制
D.4.1 成分
磷酸氢二钠(Na₂PO₄ · 12H₂O)
磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)
氯化钠(NaCl)
去离子水加至1000 mL
D.4.2 制备方法
4.25
g
g
g
各成分溶解到去离子水后，103.41 kPa(121℃) 高压30 min 灭菌后，按99 mL
溶液加入灭活健康
兔血清(56 ℃水浴灭活30 min)1mL 混合，即为间接血凝稀释液。
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